双特异性抗体（bsAbs）简直是生物界的 "双面间谍"，凭借一手 "左右开弓" 的结合绝技圈粉无数。它能同时盯上两个抗原靶点，搞出 1+1>2 的协同效果，连传统单特异性抗体组队都得甘拜下风。不过这位 "潜力股" 的成长之路可不顺，设计构建时总被各种麻烦绊住脚 -- 谁让它的结构复杂度比传统抗体高出好几个段位呢。这些麻烦五花八门：外源抗原结合域一融合，生物物理稳定性就掉链子；抗体链还总爱 "错点鸳鸯谱"，结果生出些难以清除的 "杂质宝宝"。想让 bsAbs 既有预期的 "超能力"，又具备优秀的 "药界潜质"，就得在设计时精打细算，再给它来一轮全方位的分子工程 "改造升级"。本文就来好好唠唠 bsAbs 设计里的那些关键考量，以及能高效打造不同分子形态 bsAbs 的先进工程原理。

       简介

       近年来，双特异性抗体（bsAbs）在治疗界可谓 "C 位出道"，为靶向治疗打开了一扇新大门。它有个独门绝技 -- 能同时对两个不同靶点 "下手"，从而协同靶向疾病通路，这可是传统免疫球蛋白组合想都不敢想的操作。虽说治疗性 bsAbs 是人工工程的 "杰作"，但在自然界也能偶尔撞见它们的身影，比如通过 IgG4 半分子的 Fab 臂交换形成的那种。

       工程 bsAbs 的结合 "十八般武艺"，让人们对它在多种疾病中的应用浮想联翩，癌症、自身免疫性疾病、传染病都可能被它攻克。最近有篇文章更是把双特异性和多特异性药物封为 "疗法新势力"。bsAb 的治疗潜力让这个领域成了 "香饽饽"，竞争那叫一个白热化，但也催生出不少脑洞大开的工程奇迹，看看临床阶段 bsAb 五花八门的分子形态就知道了。

       作用机制

       bsAbs 的双重结合能力，让它的作用机制（MOA）比传统单克隆抗体复杂得多，简直像个精密的 "生物钟表"。对很多 bsAbs 来说，想要发挥作用，两个结合事件得在特定时间和空间 "约会"。也就是说，两种结合特异性不仅得按特定物理排列 "站位"（比如把两个靶标拉得近近的，诱导下游信号传导），还得讲究 "时机"（比如同时连接细胞，或者按顺序靶向跨越屏障）。

       有些 bsAbs 的作用机制，光靠两个亲本抗体 "组队" 根本搞不定，这种就被称为 "专性 bsAbs"。但就算没有这种 "非它不可" 的机制，bsAbs 往往也不只是简单的 "零件拼接"，效力常常比亲本抗体组合强得多。据推测，这可能是沾了亲和力的 "光"。

       双重靶向还能提高靶标选择性和定位精度，从而减少副作用，对于避免 "误伤友军"（也就是 "在靶、脱瘤" 效应）特别有用。就算 bsAb 的活性和亲本抗体组合差不多，它在生产上也有优势 -- 毕竟只需要生产一个分子，省事儿多了。

       BsAb 的双靶向活性大致能分为 "顺式" 和 "反式" 两类。能不能把特定抗原结合域巧妙 "混搭"，针对性地作用于相同（顺式）或不同（反式）的细胞 / 分子靶点，直接决定了 BsAb 能不能发挥协同功能。

       反式作用的 BsAbs 就像 "红娘"，专找不同的靶点 "牵线搭桥"，形成物理连接。要是它结合的是不同细胞靶点，那作用机制就全靠把两种细胞 "绑" 在一起，实现细胞间 "搭桥"。双特异性 T 细胞衔接子就是个典型例子，它一边勾搭肿瘤相关抗原，一边联系 CD3（一种超强共刺激受体），成功让 T 细胞和肿瘤细胞 "见面"（图 1A）。这货还能绕过 T 细胞的自然活化流程，通过聚集低亲和力 T 细胞受体，直接把 T 细胞 "骗" 到表达肿瘤相关抗原的细胞那儿去。

       "非反式" 这个词在分子层面也有用武之地，比如双互补位抗 HER2 bsAb，它结合的是两个不同的 HER2 分子（非反式），而不是同一个（顺式）。这种交叉结合能把相邻分子连起来，诱导 HER2 发生不一样的重组，还能引发补体依赖性细胞毒性，这可是单特异性抗 HER2 抗体组合做不到的。这种分子非反式结合，主要和那些靶向同一抗原上不同且不重叠表位的双互补位 bsAb 有关。

       顺式作用的 bsAb 则像 "同小区保安"，主要盯着同一细胞上的抗原（图 1B、C）。能激活同一细胞表面两个受体的激动剂 bsAb（细胞顺式激活），可以通过精确控制受体亚基 "牵手" 来选择性调控信号传导。比如有个靶向白介素（IL）-2 受体亚基 IL-2Rβ 和 IL-2Rγ 的 bsAb，它能通过中等亲和力的 IL-2Rβγ 增强信号传导，同时削弱高亲和力 IL-2Rαβγ 的信号。还有个靶向死亡受体（DR）4 和 5 的双重激动剂双特异性 Surrobody，效力比亲本抗体组合强，可能是因为它能让 DR4 和 DR5 "抱团" 形成异二聚体。

       另一种顺式激活 bsAbs 被称为 "辅因子模拟器"，主要作用是帮酶和它的 "专属底物" 找准位置（图 1F）。凝血因子 FVIIIa 模拟物就是这么个角色，能促进 FIXa 和 FX "相遇"。这俩一旦 "组队"，就会生成活化因子 Xa（FXa），这可是凝血途径的关键 "推手"，所以这类 bsAb 和血友病 A 的治疗关系密切。对于那些产生了抗 FVIII 同种抗体的患者来说，重组 FVIII 治疗基本没用，这种 bsAb 辅因子模拟物可就成了 "救星"。

       图 1. bsAb的特异性作用机制。(A)反式细胞桥接通过 bsAb 在不同细胞之间建立了物理连接。该机制尤其适用于 T 细胞重定向 bsAb，因为这种物理连接有助于靶向激活 T 细胞的细胞毒性。(B)受体的顺式桥接引起激动剂交联，并激活相关的受体信号传导。(C)顺式拮抗作用阻断受体结合，从而阻止信号通过受体复合物进行传导。(D)搭载型 bsAb 利用一种特异性靶向受体，该受体有助于跨膜转位到原本无法进入的区室，而另一种特异性则在此发挥其功能。闪电表示由抗体结合介导的活性。(E) BsAb可以发挥定位效应。例如，激动剂 bsAb也具有肿瘤靶向特异性，通过将激动剂机制限制在肿瘤标志物存在的位点，限制了靶向、非肿瘤效应。(F) BsAbs通过准确定位酶和底物充当辅助因子模拟物。

       也可以用拮抗性 bsAb 来 "捣乱" 信号通路，它们会霸占细胞受体，不让可溶性受体配体 "靠近"。这类拮抗性 bsAb 常被用来阻断免疫检查点受体，这可是抗癌免疫治疗里的 "明星靶点"。比如双重阻断免疫检查点通路，或者同时盯上免疫检查点和抗肿瘤免疫的负调节因子（像与不良预后相关的 TGF-β）。

       顺式作用的拮抗性 bsAb 还能靶向相关或重叠的信号通路。所以这类 bsAb 可以一边对付原发性癌症相关通路，一边处理那些可能因为原发通路被阻断而 "冒头" 的相关通路，从而阻止癌细胞 "逃之夭夭"。HER2xHER3 双特异性抗体就是个例子，HER3 的上调可是 HER2 抑制剂耐药的 "罪魁祸首"。

       激动剂型 BsAbs 的发现可比拮抗性的难多了，毕竟抗体的激动活性受一堆难以捉摸的因素影响。比如有研究发现，激动剂型抗 CD3 BsAbs 的细胞毒活性就和亲和力、表位、分子几何形状脱不了干系。相比之下，有效的拮抗剂通常只要亲和力高，能和天然配体 "抢位置" 阻断其作用就行。另外，把 BsAbs 组合起来还能获得治疗效应机制的额外协同效果，不过这可能会让作用机制更复杂，给 BsAb 设计再添点 "麻烦"。

       Fc 的作用

       所有天然抗体都带着个 "功能小助手"--Fc 区，它对抗体的效应功能至关重要，通过和同源 Fc 受体以及补体蛋白等可溶性免疫介质结合，触发宿主细胞反应。对 Fc 蛋白和糖进行 "改造"，能消除或大幅增强 Fc 介导的效应功能，比如 NK 细胞的抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）、巨噬细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），甚至某些 CD8 T 细胞反应。

       人们在设计传统单特异性抗体的 Fc 区上花了不少功夫，就是为了让它具备天然同种型没有的效应功能（或者去掉某些功能）。比如给 IgG1 抗体加个 FcγR 沉默突变，就能造出效应子减少的版本，但还保留着 IgG1 的优良特性。反过来，搞搞糖工程，比如给 Fc-IgG1 N - 糖去掉核心岩藻糖，或者做点突变，能增强和某些 Fc受体的结合，从而提升效应功能，像 FcγRIIIa 介导的 ADCC 或 ADCP。这些效应调节突变或糖工程，通常和 bsAb 常见的突变（比如用于链转向的突变）不冲突，所以在含 Fc 的 bsAb 里也能组合使用。

       根据预期的药理作用（MOA），有些 BsAb 可能更适合 "改造" Fc 区，有些则完全不用动。临床开发的 BsAb 大多都带着 Fc 区，毕竟这个结构域能用 Protein A轻松纯化，而且 FcRn 循环还能延长半衰期。含 Fc 区的 BsAb 根据分子几何结构，大概能分成对称型和非对称型。

       虽说 Fc 区改造技术挺成熟，但有时候，基于小片段的 bsAb 比大型 IgG 样 bsAb 更有优势。基于片段的 bsAb 通常是把独立抗原结合结构域通过基因融合 "拼" 出来的，也能用多聚化结构域组装。这种方法的好处是，产物通常个头小，还没有重要的糖基化位点，用细菌或酵母这类简单表达系统就能高产。

       基于片段的 BsAb 通常就一两条多肽链，大大降低了因链错配产生 "杂质宝宝" 的风险，这可是那些个头大、结构复杂的 BsAb 常遇到的头疼事。而且，抗原结合结构域通过简单基因融合，在价态和特异性组合上特别灵活，比如能搞出 1+3 和 3+3 的 BsAb 形式。

       传统上，不含 Fc 区的基于片段的 bsAbs 多是用 scFv 片段做的，把它们以不同方式组合，能形成 BiTE、TandAb 或 DART 分子，这些都是 scFv 基片段 bsAbs 的主要类型（图 2A）。不过 scFv 片段常有点 "小脾气"，热力学不稳定，还爱搞 VH-VL 错配，结果生成不想要的自组装产物。

       scFv 的这些 "毛病" 让人们把目光投向了单域抗体（sdAbs）。sdAbs 也是小个子（约 15 kDa）的抗原结合域，能通过基因融合形成基于片段的 bsAbs，而且它稳定又结实，本质上是单体，不容易发生不良自组装。把 sdAbs 分别融合到 CH1 和 Cκ 上，不用接头也能组合，借助恒定结构域的自然配对作为二聚化基序，就能生成小的 Fab 样 bsAbs。当然啦，抗原结合结构域的组合方式还有很多，远不止上面说的这些。

       基于片段的 bsAb 有个潜在 "短板"-- 个头小又没有 FcRn 结合区，所以清除得快。不过在某些应用和形式中，这个问题已经得到解决，比如把 bsAb 和 HSA 偶联，或者加个抗 HSA 抗体片段。

       图 2 .根据分子结构分类的最常见 bsAb形式的示意图。（A）基于片段的 bsAb 是由不带 Fc 结构域的小抗原结合片段组合而成。其构建单元通常是 scFv 片段或 sdAb。（B）对称 Fc 结构 bsAb 由一到两条多肽链表达，通常通过将额外的抗原结合片段融合到 IgG 骨架上来实现。（C）不对称 Fc 结构 bsAb 由两到四条多肽链组装而成。不对称 bsAb 需要采取措施避免链错配。示意图中的小"旋钮"和"孔"用于一般性地表示需要使用链转向技术来确保 HC:HC 异二聚化和/或正确的 HC:LC 配对的位置。

       对称双特异性抗体

       对称型 bsAb 堪称抗体界的 "标准款"，外形酷似 IgG，严格遵循 HC2LC2 的结构套路。但别以为它就此墨守成规 -- 它偷偷融合了额外的外源结合域，摇身一变成为能同时瞄准两个抗原的 "双料选手"。

       正因如此，这些 bsAb 大多是四价的 2+2 型双特异性抗体（每种抗原各打两枪），但若想升级火力，通过双融合还能改造成六价的 2+4 型 bsAb。要说最常见的四价 2+2 型，那可就有不少成员了：scFv-IgG 融合体、DVD-Ig、串联 scFv-Fc、sdAb-IgG 融合体，还有 tetra-VH IgG（见图 2），个个都是武林高手。

       对称型 bsAbs 的一大 "懒人福利" 就是组装起来特别省心，只需表达一两条不同的多肽链就行。这意味着跟那些需要共表达三到四条多肽链的非对称 bsAbs 比起来，它在初始筛选时，质粒转染比例的优化工作简直是小巫见大巫。而且 HC2LC2 结构还大大降低了抗体链组装出错的概率，纯化方案自然也就简单多了。反观非对称 bsAbs，常常得额外加几道纯化工序，才能清除那些因组装失误产生的 "不合格产品"。

       不过，凡事有利有弊，HC2LC2 结构也限制了价态的 "自由度"，因为抗原结合域总是成对出现。这就让它在某些特殊场合束手束脚，比如遇到需要单价靶向以防止不良交联的抗原（像 CD3 这种），就只能望洋兴叹了。

       在设计对称型 bsAbs 时，选对外源抗原结合域可是个技术活。以前大家偏爱 scFv，毕竟它从常规抗体的 Fv 结构域衍生出来很方便。但现在，小个子 sdAb 正凭借独特优势异军突起，成为炙手可热的融合搭档。它天生娇小，还是单体，不像 scFv 那样总爱搞 "小团体"-- 也就是不良自组装和聚集，实在是省心不少。

       通常会用 10-25 个氨基酸的甘氨酸 - 丝氨酸接头来融合外源抗原结合结构域，这家伙在水溶液里柔韧性和稳定性都没得说，堪称 "最佳粘合剂"。其他 bsAb 构建体则另辟蹊径，选用源自天然抗体接头区域的接头，比如抗体铰链区，或者连接 Fv 和 CH1/Cκ 的柔性接头。选对合适的接头，对保证抗原结合结构域的正确间距和展示效果至关重要。有研究发现，接头长度还会影响 DVD-Ig 分子的抗原结合能力和稳定性，真是差之毫厘，谬以千里。

       抗体的模块化特性简直是设计师的福音，外源抗原结合结构域既可以融合在支架多肽链内部，也能接在末端，这样就能打造出结构五花八门的 bsAbs，完全可以根据需求量身定制。虽然这些外源抗原结合片段通常会跟全长 IgG 分子结合，但它们也能直接与 Fc 结构域融合，让构建体比全长 IgG 分子小巧玲珑，同时还能保留 Fc 区的功能，可谓一举两得。

       除了把独立的抗原结合结构域融合到 IgG 支架上，还有些别出心裁的策略用来开发对称的 IgG 样 bsAbs。比如四重 VH IgG，它通过把不同的结合特异性分配到 Fv 的每个可变域上（用独立的 sdAb 替换 VH 和 VL）实现双特异性。还有更绝的，把单个 Fab 域的 6 个互补决定区（CDR）在空间上分成 VH 互补位（CDRH1、CDRL2 和 CDRH3）和 VL 互补位（CDRL1、CDRH2 和 CDRL3），再把这些单独的互补位组合起来，就形成了称为 DutaFab 的单个双特异性 Fab 域，真是把 "拆分重组" 玩得明明白白。

       非对称双特异性抗体

       非对称 BsAb 的分子几何结构，让它的设计和生产难度比对称 BsAb 高出不少，这主要是因为不同抗体链共表达时，很容易产生抗体相关杂质，就像一锅粥里混进了沙子，让人头疼。尽管有这些实际难题，非对称 BsAb 依旧在进入临床开发的 BsAb 类型中占据主力位置，看来实力不容小觑。

       非对称 BsAb 的一大显著优势是，它的分子几何结构跟 IgG 的天然结构长得很像，这就让它能充分利用 IgG 良好的类药特性，相当于站在巨人的肩膀上。而且非对称结构让价态拥有了高度灵活性，比如能形成单价特异性（1+1），这可是对称 bsAbs 办不到的 "独门绝技"。另外，那些结构跟 IgG 分子相似度高的非对称 bsAbs，被认为能降低免疫原性风险，这可是个大大的加分项。不过要说明的是，非对称 bsAbs 也能形成偏离严格二价 Y 形 IgG 几何形状的结构，比如三价 2+1bsAbs，真是个灵活的多面手。

       HC:HC 配对

       非对称双特异性抗体（bsAb），最让人头疼的问题就是多肽链错配，结果就是产生一堆产品相关杂质，简直是生产路上的 "拦路虎"。许多非对称双特异性抗体都得靠两种不同重链（HC）的异二聚化来发挥作用，所以大家对能促进 HC 异二聚化的 HC 转向平台格外关注，都盼着能找到解决问题的钥匙。

       目前已经开发出不少 HC 转向平台，大多源自行业内部，它们的工作原理是在 CH3 域中创建互补界面，而 CH3 域可是控制抗体结构完整性的关键部位。不过，对结构如此重要的 CH3 结构域进行突变，常常也会影响 bsAb 的热稳定性，真是牵一发而动全身。

       虽然这些 CH3 转向平台的详细设计原理在其他地方已有透彻的研究，但值得注意的是，这些平台都在努力引入结构互补的突变，目的是让 HC 更倾向于异二聚化，同时抑制 HC 同二聚体的形成，就像在给 HC"牵红线"，让它们按指定对象结合。

       其中，第一个被报道且应用最广泛的平台是旋钮入孔（KiH）。它的操作很有意思，在一个 HC 里安插一个大个头的色氨酸，在另一个 HC 里配上空间互补的小个子残基，就像钥匙和锁一样严丝合缝。KiH 策略之所以被广泛采用，一是因为它在抑制 HC 同型二聚体方面效果显著（除了极少量的孔 - 孔同型二聚体），二是因为它的专利已经过期，不用再为专利费发愁。这样一来，KiH 就为构建不对称 bsAb 提供了一条相对轻松又免费的路，要知道在这个领域竞争激烈，还多由行业主导，其他好几个平台都受专利保护着呢，想用上可不太容易。

       在构建用于异二聚化的 HC 时，得明白 HC 异二聚体的相对丰度其实是一种平衡状态，并非固定不变。这种平衡会受到多种因素影响，比如相对质粒和表达水平，通常得通过优化质粒转染率来控制。这事儿可能相当费时间，尤其是在表达许多不同的 bsAb 时，简直是对耐心的极大考验。

       比如我们最近就报道了一种不对称 IgG/sdAb-Fc 构建体，调整 HC 质粒转染率后，两条 HC 链的表达才达到最均衡的状态，这说明两条 HC 可不会乖乖地平等共表达，还得靠人为调节。其他研究也发现，可变结构域的性质会影响 HC 异二聚化，真是一环扣一环。

       CH1 结构域在 IgG 分子的组装和运输中扮演着重要角色，这也解释了为什么当 Fab 结构域被 sdAbs 或 scFvs 等片段取代后，HC 的表达行为会发生变化。有趣的是，有人通过对高表达的 λ 链进行密码子去优化，来平衡表达量较低的 κ 链，居然还改进了异二聚 κλ bsAb 的组装，实际上提高了目标 bsAb 的产量，这波操作真是让人眼前一亮。

       HC:LC 配对

       在双特异性抗体（bsAb）的世界里，HC 和 LC 的配对就像一场严格的相亲大会。选择拥有共同 LC 的 bsAb，就好比给相亲双方定了个共同的择偶标准，能从源头上消除错配的尴尬。不过，要找到这样的 "共同语言" 可没那么容易，不仅耗时，还得在序列多样性上做出让步，这无疑给寻找既专一又深情（高亲和力）的结合物增加了不少难度。

       但话说回来，共同 LC 这种方法也不是全无好处。它只需表达三条多肽链，在可制造性上算是松了口气，就像原本要准备三桌饭菜，现在两桌就够了，确实省心不少。同理，找到有共同 HC 的 bsAb 也能避免 HC 错配的问题，算是另一种 "捷径"。

       其他方法则像是给 Fab 装上了 "导航系统"，通过合理设计让它们别走错路，防止在不同多肽链共表达时闹 "乌龙"。比如 Crossmab、正交 Fab 界面、交换 CH1/CL 结构域、给天然链间二硫键做 "工程改造"，还有嫁接 IgE 衍生的异二聚化结构域，这些操作都像是给抗体配对上了多重保险。

       使用两种不同的 HC 和 LC，能让 VH 和 VL 结构域自由 "谈恋爱"，在寻找靶向特异性 bsAb 时不受束缚，尽情展现多样性。可另一方面，4 条多肽链要想平衡共表达，简直比让四个性格迥异的人同时合拍地跳一支舞还难。这就需要在载体设计和生产克隆生成上多花心思，甚至还会给下游工艺带来额外压力，像是一场艰难的协调工作。

       当然，也可以先让每个抗体半单独表达，之后再组装成最终的 bsAb 构建体，通过这种 "先分居后同居" 的方式得到正确的 HC:LC 配对。但这种策略就像在原本的生产流程中加了道 "中间商"，不仅要额外克隆生成和生产两个组件，还得处理铰链二硫键的充分还原和氧化等棘手步骤，简直是给自己找麻烦。

       还有些策略更绝，把其中一个 Fab 臂换成单链 Fab（scFab）结构域，让 bsAb 只由 3 条多肽链组成。scFab 的柔性接头就像个灵活的 "月老"，能促进 VH/CH1和 VL/CL 的正确配对。有意思的是，有些 Fab 域像是专一的 "痴情种"，天生就喜欢和同源的 HC:LC 配对；而另一些则是 "大众情人"，在 HC:LC 配对上显得比较随意。研究发现，这种配对偏好主要由 CDR 决定，这些发现或许能帮我们在选择兼容的 HC:LC 对或寻找常见 LC 时少走弯路。

       要是想从根本上避免 HC:LC 错配的问题，还有个简单粗暴的方法：用 scFv 片段或 sdAb 等抗体片段替换一个或两个 Fab，让 bsAb 最多只带一个 LC，这样就从源头上杜绝了错配的可能，堪称 "釜底抽薪"。

       由于 bsAb 正确链配对太重要了，人们对高级分析和高效下游纯化工艺的兴趣也日益浓厚，毕竟得准确找出并清除那些 "错配分子"，还得给它们定量呢。

       替代链转向

       除了上面说的组装方法，人们还探索了一些更依赖化学处理的策略，算是 "化学媒人" 的功劳。比如表达一种 IgG 样 bsAb，它由 4 条不同的多肽链组成，以单一构建体的形式表达。抗体链之间通过连接子连接，这个连接子就像个 "指挥家"，控制着链的组装，而且在表达后还能被去掉。给 BsAb 链加上亮氨酸拉链也能控制它们的结合，全长 IgG 分子还能通过 SpyTag/SpyCatcher 系统或者点击化学 "牵手成功"。

       分子几何构形

       BsAb 可不仅仅是各个部分的简单相加，选择最佳的分子结构就像给房子选户型，是获得所需功能的关键设计考量。这意味着由相同分子构建块组成（总氨基酸含量相同），只是分子几何形状不同的 BsAb，可能会表现出天差地别的活性。

       双重靶向通常是个复杂的活儿，因为 BsAb 的配置得同时考虑内部和外部限制才能达到预期的治疗效果。内部限制是分子几何形状自身带来的，比如结合域之间的空间位阻，就像两个人站得太近会互相妨碍一样。有研究检查了一整套对称的 sdAb-IgG bsAb，包括镜像特异性，发现抗原结合域的结合亲和力会受到分子几何结构导致的域间空间位阻影响，而且当 sdAb 与 LC 连接时，这种影响比与 HC连接时更明显。不过，这种内部限制可以通过结构工程来缓解，比如延长连接子，增加分子内的灵活性和靶标结合之间的距离，就像把两个吵架的人拉开点距离。

       外部限制则是由靶环境的空间组织造成的，BsAb 得摆出特定的 "姿势" 才能实现所需的时空靶标结合。对于有细胞间活性的 BsAb 来说，这种外部限制尤为明显，毕竟细胞表面受体的空间结构本身就很复杂。比如，T 细胞活化所需的免疫突触，就取决于 T 细胞抗原受体和肽 - MHC 配体的间距。既然通过 T 细胞重定向 BsAb 建立的人工免疫突触和天然免疫突触长得很像，那在设计这些 T 细胞重定向 BsAb 时，就得参考自然间距的限制，别搞 "非主流"。

       再举个例子，当 Fynomer（源自 Fyn 激酶 SH3 结构域的小结合蛋白）连接在 N端而不是 C 端时，FynomAbs 的细胞毒活性更高。这说明，通过调整分子几何形状来实现最佳的位间定位，效果可能出奇地好。如果短位点间距更有利，那基于小片段的配置或许是个不错的选择。同样，合理设计分子结构和抗原结合域的位点间距，还能影响作用机理。在 T 细胞结合 scFv-IgG bsAb 中就得到了证实，将 scFv C 末端融合到 LC 上获得的较短位点间距，在体外和体内都展现出了更优异的抗肿瘤效果。而且，靶向 CD19 和 CD3 的基于片段的 DART 分子，比由相同结合域组成的串联 scFv 表现出更好的细胞裂解作用，看来 DART 分子更紧凑的 "身材" 有利于维持细胞间接触。

       受体空间组织的重要性，让人们开始关注受体：抗体复合物的结构分析，希望能揭开有效抗体结合的秘密，从而设计出更棒的抗体疗法。其实，位间距离不仅在细胞间靶向中很重要，对于两个表位都在同一靶细胞上的 bsAb 也同样关键。比如，双位抗 HER2 bsAb 在非活性交联构象中有效捕获 HER2 的能力，就很大程度上取决于分子几何形状，就像用合适的网才能网住特定的鱼。

       鉴于 bsAb 结构的影响这么大，想知道哪种 bsAb 最有效，光分析亲本单特异性抗体可不够。所以，我们得努力开发功能性筛选策略，不仅要评估亲本抗体的结合能力，还得筛选组合 bsAb 组，看看哪种分子结构和抗原结合域的组合最搭。

       而且，影响 bsAb 效力的不只是分子几何形状，还有特异性的相对方向。比如，把抗 HER2 scFv 与抗 PD1 IgG 支架融合，和反过来把抗 PD1 scFv 与抗 HER2IgG 融合相比，HER2 的结合率明显降低，这说明 "谁站前面谁站后面" 影响还挺大。基于片段的 bsAb 也有类似的情况，相对方向不同，效果可能就差远了。

       在 bsAb 的设计中，不仅要优化分子构型和价态来达到所需的作用机制（MOA），还得优化不同抗原结合臂之间的相对结合亲和力。这可能就需要评估各种亲和力变体的组合，才能找到最佳搭配，就像调配鸡尾酒，比例对了味道才好。

       平衡结合亲和力的重要性，让人们对机制建模产生了兴趣，希望通过它理解亲和力相互作用，从而更科学地设计 BsAb。这种亲和力调节对于靶向 CD3 和肿瘤相关抗原的 T 细胞结合 BsAb 来说尤其重要，而且相对结合亲和力已经被证明会影响疗效和选择性，可不能马虎。

       可开发性考虑

       可开发性这档子事，光让双特异性抗体（bsAbs）像神枪手一样精准结合抗原还不够，它还得具备一身 "好药相"-- 比如表达量得像打了鸡血一样飙升，稳定性得堪比老陈醋越放越香，别动不动就自己抱成一团（自交联和聚集），溶解度也得给力不能掉链子。这些特质合在一起，我们管它叫 "可开发性特征"。就像相亲前得先看看照片筛一轮，药物开发早期也得给 bsAbs 做个可开发性体检，免得辛辛苦苦砸了钱，最后发现这货根本成不了临床候选的 "潜力股"。

       现在大伙儿都在忙着搞计算机预测工具和高通量分析，想在早期就揪出那些 "先天不足" 的候选者。但问题是，这些方法大多是给传统单克隆抗体制订的 "体检标准"，用到 bsAbs 身上就得格外留神了 -- 毕竟给 bsAbs 搞工程改造时，很可能一不小心就捅出些意想不到的 "篓子"。比如说，我们最近就发现，把单链抗体（sdAb）嫁接到 IgG 这个 "支架" 上，表达量和稳定性立马就变了脸，而且变得有多离谱，全看分子的 "身材比例"、单链抗体接在 IgG 的哪个 "部位"，还有接上去的 "零件" 数量。这研究算是把话挑明了：分子的 "颜值即正义"（最佳几何结构）有多重要，单链抗体的 "体质" 可不能光看单个零件或者它 "爹妈"（亲本抗体）怎么样就下结论。

       bsAbs 的 "造型设计" 可能引发的其他 "健康问题" 还不少，比如动不动就碎成几段（碎片化）、特别爱扎堆（聚集倾向），还有工程改造出来的二硫键可能一言不合就 "闹离婚"（还原）又 "复婚"（再氧化）。所以说，分子的 "身材" 在化学和生物物理稳定性这两块，绝 对是设计时的重中之重。

       不光如此，分子的 "穿搭风格"（形式）还会影响 bsAbs 在体内的 "保质期"（药代动力学），大伙儿也在想办法搞出能预测这一点的体外检测方法。但架不住 bsAbs 的 "穿搭" 实在太多样了，各种形式和 "身材" 让人眼花缭乱，以至于到现在都没法给它们的可开发性画个统一的 "标准像"。

       虽然搞大规模的系统研究，说不定能总结出各种 "穿搭" 和 "身材" 的共同规律，但目前的做法通常是：要么在专利平台的 "圈子里"，通过组合库高通量筛选或者多参数优化，找出那些 "体质" 不错的 bsAbs；要么就是走 "捷径"-- 把单个表达的抗体组分用生物偶联的方式拼起来，不用费劲吧啦地逐个生产，就能攒出一大堆 bsAbs 来筛选，这操作简直是 "搭积木式" 高效。

       要是想针对性改善 bsAbs 的 "体质"，就得对那些 "拖后腿" 的片段下功夫优化。比如给片段 "强身健体"，让它更耐热、更易溶、化学性质更稳定，也别老想着 "抱团取暖"。但关键是，优化完之后还得把它放回完整的 bsAbs 里再测一遍，免得 "单个零件给力，组装起来掉链子"。

       对 "药相" 的要求也能提前融入发现过程，比如在筛选的时候就给 "好药相" 设点 "加分项"。

       结论

       双特异性抗体（bsAbs）绝 对是治疗界的 "潜力新星"，在各种医疗场景里都憋着一股狠劲想大显身手。但这货能不能成，全看设计和构建够不够给力 -- 既得让它治病够猛，又得让它的理化性质够乖，这平衡可得拿捏准了。

       就像前面说的，bsAbs 的 "战斗力" 和 "表现分" 之间的关系错综复杂，全看它的 "结构造型" 给不给力。现在大伙儿都在使劲儿设计那种既能双靶点 "开黑"，又能满足开发要求，甚至能超越传统单特异性抗体的 bsAbs。

       这篇文章掏心窝子分享的这些见解，就是想说明白 bsAbs 工程有多 "烧脑"，也想强调一句：想让它的治疗潜力彻底爆发，战略设计这步棋必须走对。值得一提的是，我们深挖了工程策略和实际考量里的那些 "弯弯绕绕"，就是想弄清楚高效 bsAbs 设计里藏着的那些 "坑" 和 "机遇"。把这些设计原则的复杂门道捋清楚了，就能给 bsAbs 作为多功能 "治疗利器" 的持续进化添砖加瓦，也能给未来更牛的 bsAb 疗法研究开发指条明路。

       原文来源：A.V.Madsen, L.E.Pedersen, P.Kristensen, et al., Design and engineering of bispecific antibodies: insights and practical considerations. Front. Bioeng. Biotechnol., 2024.