编者按：体内CART已然成为研究热点，就在昨日，8月21日，吉利德公司 (Nasdaq: GILD) 旗下的Kite宣布，以3.5亿美元收购Interius BioTherapeutics，Interius是一家开发体内 CAR 疗法的生物技术公司。从官网来看，技术路径走的是慢病毒路径。如今体内CART主要有两类技术流派，目前来看LNP有LNP的问题，慢病毒有慢病毒载体的问题。体内CART虽然很热门。但并不是一个成熟的技术平台，仍然有很多需要探索的。同时能否优于TCE，或者下一代TCE也是很难说的。今天邀请了一位在体内CART研究颇深的专家来讨论这个话题。这也是首次Antibody Research公众号约稿。

       当谈论IN VIVO CAR-T的时候，到底在讨论什么

       最近组织了好几场关于IN VIVO CAR-T领域的闭门会，邀请了相关领域的研发者、创始人和投资人等，引起了一些反响，大家都希望我写写总结。我自知天生愚钝，文笔拙劣，担心不能把各专家的真知灼见准确地表达出来，一直未动笔。不过最近看到行业逐渐热闹起来，行业潜在的问题似乎被有意无意的被隐藏起来，觉得还是有必要和大家好好聊聊。今天出第一期，主要聚焦下面3个问题：

       1.为什么IN VIVO CAR-T的热潮是在当下？

       2.如何看待各病毒载体的IN VIVO CAR-T技术平台？

       3.未来的技术演化到底要关注哪些问题？

       为什么IN VIVO CAR-T的热潮是在当下

       记得2021年CAR-(i)NK正火爆的时候，我在一个会议上问了个问题：2017年FDA就批准了CAR-T上市，作为同样重要的免疫细胞，为什么CAR-(i)NK产业发展还在这么早期？到底什么原因导致了CAR-(i)NK的发展进度远慢于CAR-T呢?现在的这些原因都解决了吗？后续基于上面的疑问，我出了几篇关于CAR-(i)NK的行业报告，在这些报告里面，比较准确的提示出CAR-(i)NK技术平台的风险与优势、面临的挑战、成药性的困难等，并且对当时的某外国明星CAR-(i)NK企业的巨大风险发出警示，几个月该公司的数据发布后，股价一泄千里至今还在低谷。

       同样的逻辑，上述的几个问题，可以问问当下的IN VIVO CAR-T，到底是怎样的底层逻辑决定了IN VIVO CAR-T现在可以爆发？可以成药？可以成为大药？

       体外自体和异体CAR-T细胞疗法与体内CAR-T细胞疗法的概述

       我们知道IN VIVO CAR-T能成药的关键点是在于载体的成功，一个理想的载体需要能满足以下几条：

       ①特异性靶向:在体内只有效转染(静息态)T细胞,避免非特异性基因转导和脱靶效应。

       ②高效的转染效率:让体内达到一定数量的CAR-T细胞才能获得潜在治疗效果;确保CAR基因在T细胞中的稳定表达和功能活性。

       ③较低的免疫原性。

       ④避免载体失活:避免被自身免疫系统和补体系统灭活。

       ⑤生产简易，成本极低

       所以对于各IN VIVO CAR-T平台/公司的评估，评估其载体特点及后续的转染、表达、安全性等参数是重中之重。目前主流的载体分为病毒载体和非病毒载体，后续我将根据载体及代表公司，做个系列的文章来梳理。今天重点来讨论一下病毒载体，特别是慢病毒载体。

       1.病毒载体技术路径发展沿革

       慢病毒载体结构及特点：

       慢病毒属于逆转录病毒科的RNA病毒家族。早期慢病毒载体，由人类免疫缺陷病毒(HIV)改装而来，随后，猫免疫缺陷病毒(FIV)、猿类免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、绵羊髓鞘脱落病毒(MVV)等载体相继研发。

       慢病毒载体的结构：

       第一代慢病毒载体为双质粒系统，基本保留了HIV的所有组件，包膜通常采用 VSV-G，以增强载体的广谱感染能力。虽然这种系统实现了基因转送，但由于包含大量HIV 元件，存在生成复制性慢病毒（RCL）的风险，因此逐步被更安全的设计所取代。

       第二代慢病毒载体为三质粒系统，分为包装质粒、包膜质粒和载体质粒，第 2代系统去除了所有 HIV 的辅助基因（vif、vpr、vpu、nef），仅保留必要的结构（gag、pol）和调控（tat、rev）功能基因。尽管同样采用三质粒模式，但由于辅助基因被删除，RCL 风险显著降低。这一代系统广泛被实验室用于研究场景，部分仍依赖 Tat 激活 5′ LTR，从而体现其对 Tat 的依赖性。

       第三代慢病毒载体系统进一步强化了安全性，进行了多个关键优化：

       Tat 基因被完全移除，并采用融合型异源启动子（如 CMV 或 RSV）替代 5′ LTR，从而去除了对 Tat 的依赖；

       包装功能分离：将gag/pol 和 rev 放在不同质粒内，再加上单独的包膜质粒与转导质粒，共形成四质粒系统；

       引入自失活（SIN）设计：删除 3′ LTR 中 U3 区域（即 ΔU3），使得整合后的病毒难以再次启动转录，进一步降低安全风险。该设计显著减少了生成 RCL 的可能性，广泛应用于临床前研究与 CAR-T 等基因治疗研发中，尽管其操作复杂、产物滴度相对较低。

       第四代慢病毒载体：当前对于第四代慢病毒载体并无统一定义，且在研究中应用较少。Oxford推出了其TetraVecta?，将其称为第四代慢病毒载体体系，并且基于其开发了新型的in vivo CAR-T的体系，将包膜蛋白替换为尼帕病毒包膜，感兴趣的同学可以查阅其近期发表在Molecular Therapy的论文https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2025.07.006。

       通过上面的慢病毒载体发展路径可以得知，优化的方向是为了获得更强的感染能力、宿主广泛（分裂和非分裂细胞）、能够整合进宿主DNA且筛选后稳定遗传、表达潜伏期短、更低的免疫原性、更高的生产滴度、更高的安全性。

       同时，Paul-Ehrlich-Institut分子生物技术和基因治疗研究小组负责人Christian Buchholz在20年前就有了早期的灵感。基于2005年发表在Nature Biotechnology杂志上的一项研究（溶瘤病毒麻疹病毒通过引入编码靶向肿瘤特异性CD38、EGFR和EGFRvIII的单链抗体的基因，有效进入肿瘤细胞，实现了定向的抗肿瘤作用），Buchholz想知道一个类似的策略是否可以帮助慢病毒载体进入特定的细胞类型。与期望相符，他在2008年报告称，CD20靶向的慢病毒载体优先被B细胞"吸收"；2012年，其研究又证实，CD8靶向载体能够进入T细胞。但要将慢病毒载体转化为药物，需要强有力的有效载荷。随着杀伤B细胞的CAR-T细胞疗法在2010年首次进入临床，Buchholz看到了机会。2018年，他发表最新成果研究显示，利用慢病毒载体CD8‐LV（特异性靶向人类CD8细胞）能够直接在体内产生人类 CD19‐CAR T细胞，并导致CD19 B细胞清除。

       一些biotech开始尝试开发这一策略，并逐渐做出一些调整，包括细胞靶向片段的选择、治疗载荷的选择等。但其中还面临一些其他的问题需要解决。

       我们知道，慢病毒感染细胞主要是通过VSV-G/LDL-R通路实现的，LDL-R几乎在绝大多数细胞上都有表达，这就表明慢病毒具有泛嗜性特征，但是在EX VIVO CAR-T的工艺中，因为感染都得分选富集后的T细胞，所有慢病毒得泛嗜性特征不会带来脱靶等风险。但在IN VIVO CAR-T平台中，如果不解决泛嗜性问题，直接回输慢病毒这个终产品，其安全性风险将无疑是巨大的。目前解决慢病毒泛嗜性的通常做法是2类：

       1．是针对VSV-G进行基因突变，使其降低/失去和LDL-R结合的能力，比如EsoBiotec在I331E位点进行突变、Interius在I182E/T214N/T352A位点进行突变、Kelonia在K47Q/R354A位点进行了突变、Vyriad等企业用的是这个策略。这个策略的好处是依然采用了有大量的数据验证的VSV-G， 但是因为VSV-G蛋白和LDL-R结合的点位非常有限，所以留给后来者进行突变的机会，其实越来越少，在后续的产品中，是否会产生专利风险，值得关注。

       2．是筛选新的假型蛋白，比如Umoja采用了Cocal-V-G假型蛋白、Oxford采用的NiV GM△34+F△22体系、易慕峰生物采用了MxV-G假型蛋白并对其突变的策略。这个策略好处是差异化的技术平台未来会更有可能得到大的交易机会，无知识产权风险、更大的改造空间；挑战在于能否筛到合适的新的假型蛋白，并且找到适合的突变位点，新的新的假型蛋白数据少，科学性上需要更多的验证。

       相信聊到这样，就会有人提问了，慢病毒既然失去了与LDL-R结合的能力，也就失去了感染细胞的能力，如何实现精准的靶细胞感染呢?这里就需要采用增加T细胞靶向模块，常用的细胞靶向模块的有:

       1.靶向非激活型T细胞的策略: 主要靶向CD7+T细胞，比如Interius

       针对非激活型 T细胞的策略，主要聚焦于识别 CD7 阳性的静息状态 T细胞，例如 Interius BioTherapeutics 所开发的 INT2104。该疗法利用工程化的慢病毒载体，通过静脉注射直接靶向 CD7?的 T细胞和 NK细胞，将 CAR 基因传递至目标细胞，在体内原位生成 CAR T 和 CAR NK细胞，实现对 CD20? B 细胞恶性肿瘤的打击。值得一提的是，Interius 在 2024 年 7 月已获得澳大利亚人类研究伦理委员会（HREC）批准，启动其首个人体 I 期临床试验。感兴趣的同学可以参考其发表在Molecular Therapy的论文，该论文对其产品设计有详细的描述，链接如下：Targeted in vivo delivery of genetic medicines utilizing an engineered lentiviral vector platform results in CAR T and NK cell generation - PubMed。

       靶向激活型的策略:主要靶向CD3+T细胞，比如Kelonia、EsoBiotec、Umoja等，其次，针对激活型 T 细胞的策略则主要利用 CD3或TCR等分子为靶点进行T细胞的激活和转导。该领域的BD/收购交易明显更为活跃。Umoja Biopharma 的 UB-VV111，基于其 VivoVec? 平台，可识别并通过CD3/CD80/CD58三重信号分子激活T细胞，在体内直接递送 CAR 基因完成CAR-T 的原位生成。Umoja 成为了目前唯一一家获得FDA IND 批准的公司。此外，此领域中另一个亮眼案例是 EsoBiotec 最近在《柳叶刀》（The Lancet）上发表了其 in vivo CAR-T 候选药 ESO-T01 的临床早期数据。该研究报道首批接受该疗法的四位多发性骨髓瘤患者中，有两位达到了严格完全缓解（sCR），其他两位取得了部分缓解，并且骨髓检测在第 28 天即显示微小残留病（MRD）阴性。这些病人接受的剂量仅为2×10^8 TU，却展现了显著的疗效，显示出 EsoBiotec 的ENaBL 平台的巨大潜力。不过需要指出的是，该临床试验也显示出与传统CAR-T疗法不一样不良反应谱，且更为快速和严重，其产品或临床方案仍需持续优化。感兴趣的同学可以参考其发表在柳叶刀的论文，链接如下：In-vivo B-cell maturation antigen CAR T-cell therapy for relapsed or refractory multiple myeloma - PubMed。

       对于T细胞的转染，特别是静息态T细胞的转染与激活能力，是IN VIVO CAR-T取得疗效的重要基础，未来病毒载体公司的疗效差异可能很大一部分原因就是来自于该模块。所以对于该指标更要认真、全面的评估和审查。

       病毒作为外来物，回输体内以后，会被机体的先天免疫系统和补体系统识别和吞噬等，这样对于最终的疗效会带来巨大的影响，为此各个公司也都做了不同的"盾牌"设计和优化，比如Esobiothec,对MHC-I进行了敲除和增加了CD47的过表达。这样的盾牌涉及对于产品的稳定表达到底带来怎么的效果，任需要持久的观察。

       畅想未来，IN VIVO带来巨大的想象力，同时也必须要清醒的认识到，这个平台刚刚起步，仍有很多问题需要回答，比如：

•        各载体转染哪些细胞才能实现与EX-VIVO细胞产品相当的治疗?

•        持续的转基因表达对于临床疗效是否必要？，特别是对于肿瘤学或者非肿瘤学的应用?

•        不同组织和细胞类型中脱靶CAR表达的后果(毒性/病理学)是什么?

•        不同载体的先天免疫原性如何影响干细胞活性、抗原呈递细胞激活并调节连续给药方案中的反应原性？

•        EX-VIVO细胞设计的CAR结构域是否是IN VIVO细胞治疗的最佳选择?

•        什么给药途径可以最大限度地提高所需细胞类型中的CAR 表达并最大限度地减少脱靶表达或先天免疫激活？

•        想要转导/转染哪些细胞类型?使用具有多种免疫谱系趋向性的配体靶问是否可以增强治疗效果?且不同的靶向分子对副作用和疗效的影响是什么?

•        IN VIVO细胞疗法是否可以更好地动员内激性免疫细胞类型来引发广泛的适应性抗肿瘤免疫反应?

•        IN VIVO 细胞疗法带来新的毒性谱是否有临床处理预案？

       《百年孤独》里说："世界新生伊始，许多事物还没有名字，提到的时候尚需要指指点点"，IN VIVO似乎正式这样的状态和阶段。所以，相信相信的力量，一起静待IN VIVO平台的崛起。

       引用：医药魔方、Nature reviews、Expert Opin Biol Ther. 2013 Jul;13(7):987-1011. doi:10.1517/14712598.2013.779249.